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一、原理
呋喃代謝物四合一ELISA檢測試劑盒組織蜂蜜版采用間接競爭ELISA方法定量檢測樣品中呋喃代謝物的殘留量。
二、適用范圍
定量檢測組織、蜂蜜樣品中呋喃代謝物的殘留。
三、呋喃代謝物四合一ELISA檢測試劑盒組織蜂蜜版特點及技術指標
* 檢 測 時 間 ：40min-70min
* 試劑盒檢測純陰性樣本的背景值＜0.05 ppb；
樣本 | 檢測下限 | 回收率 |
呋喃唑酮 | 0.2ppb | 70%-120% |
呋喃西林 | 0.2ppb | 70%-120% |
呋喃它酮 | 0.1ppb | 70%-120% |
呋喃妥因 | 0.2ppb | 70%-120% |
試劑盒檢測樣本的靈敏度、準確度和特異性：
藥物名稱 | 交叉反應率（%） |
呋喃唑酮 | 100% |
呋喃西林 | 100% |
呋喃它酮 | 100% |
呋喃妥因 | 100% |
四、所需材料
儀器：微孔板酶標儀450 nm/630 nm、均質器、振蕩器、氮吹儀、離心機、刻度移液管（10 mL）、天平（感量0.01 g）、離心管（5 mL, 50 mL）
微量移液器：10 µL～100µL、100 µL～1000µL
試劑：乙酸乙酯、去離子水、 濃鹽酸 、氫氧化鈉
五、 試劑盒組成
序 | 組成部分 | 96T裝量 |
1 | 呋喃酶標板 | 96×4孔 |
2 | 呋喃標準品*5 | 0.5-1mL |
3 | 呋喃酶標物 | 40mL |
4 | 呋喃抗體 | 7mL*4 |
5 | 底物液A液 | 28mL |
6 | 底物液B液 | 28 mL |
7 | 終 止 液 | 28mL |
8 | 20×濃縮洗滌液 | 160 mL |
9 | 2×呋喃樣品稀釋液 | 160 mL |
10 | 呋喃衍生化試劑 | 40 mL |
注*：標準品A、B、C、D、E
呋喃它酮標準品：0,0.05,0.15,0.45,1.35ppb；
呋喃妥因標準品：0,0.1,0.3,0.9,2.7ppb；
呋喃唑酮標準品：0,0.1,0.3,0.9,2.7ppb；
呋喃西林標準品：0,0.1,0.3,0.9,2.7ppb；A、B標準品各1mL，其余各0.5mL，直接使用。
六、溶液配制
配液1: 洗滌工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1 : 19體積 比進行稀釋，用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4℃環境可保存一個月，用前一天取出回溫。
配液2: 1×呋喃樣品稀釋液
用去離子水將2×呋喃樣品稀釋液 按1:1體積比進行稀釋，用于樣本的稀釋，配好后在4℃環境可保存六個月，用前一天取出回溫。
配液3: 0.1 M HCl
量取860 μL濃鹽酸加去離子水/雙蒸水混勻定容至100 mL，濃鹽酸揮發在通風櫥內操作。
配液4: 0.1 M NaOH
稱取0.4g 氫氧化鈉加去離子水溶解定容至100ml。
七、樣本前處理
樣本處理前須知：
① 處理完的樣品應及時進行下步檢測，實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
② 樣本數目超過8個時推薦使用排槍加樣。
動物組織、蜂蜜 （稀釋倍數：2）
① 稱取2.0±0.05g均質后的樣本，加入8ml
0.1 M HCl 和400μL 呋喃衍生化試劑，用振蕩器充分振蕩1min；
② 置于37 ℃過夜孵育（大約16h）；
③ 分別加入8 ml 0.1 M NaOH和20ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s；
④ 4000r/min，室溫（20～25℃/68-77℉）離心5min；
⑤ 取上層10ml乙酸乙酯相至離心管中，于50～60℃氮氣流下吹干；
⑥ 加入1.6 ml 1×呋喃樣品稀釋液（動物組織、蜂蜜），用渦旋儀渦動60s使干燥物溶解，用于分析。
八、 酶標免疫測定程序
呋喃唑酮、呋喃西林：
（1）加標準品/樣品、酶、抗體：加標準品/樣品50µL 到對應的微孔中，加入呋喃酶標物50µL /孔， 再加入呋喃唑酮/呋喃西林抗體50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應30min。
（2）洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250 µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
（3）顯色：加入底物液A液50 µL/孔，再加底物液B液50 µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應10min。
（4）測定：加入終止液50µL/孔，用酶標儀立即 測定雙波長450/630nm吸光度值。
呋喃它酮、呋喃妥因：
（1）加標準品/樣品、抗體：加標準品/樣品100µL
到對應的微孔中，再加入呋喃它酮/妥因抗體50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃反應30min。
（2）洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
（3）加酶標物100µL/孔，用蓋板膜蓋板后置37℃反應30min。
（4）洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
（5）顯色：加入底物液A液50µL/孔，再加底物
液B液50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃反應10min。
（6）測定：加入終止液50µL/孔，用酶標儀立即測定450nm處的吸光度值（建議用雙波長450/630nm）檢測。
九、 結果判定
以標準品百分吸光率為縱坐標，以呋喃標準品濃度（ppb）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中呋喃實際濃度。（詳見試劑盒專業分析軟件，以便進行大量樣本的分析計算。）
十、 注意事項
① 洗板拍干后應立即進行下一步操作。
② 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
③ 不使用過了有效期的試劑盒，不交換使用不同批號的試劑。
④ 0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質。
⑤ 在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色時間為15min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到20-30min，反之則減短反應時間。
⑥ 未提及樣本請致電本公司技術服務部。
十一、貯藏條件及保存期
貯藏條件： 2～8℃
保 質 期： 12個月
十二、問題與對策
序號 | 現象 | 可能原因 | 解決方法 |
1 | 板條不顯色或者無相應數值 | 試劑使用順序混亂，或操作步驟出錯 | 嚴格遵循實驗說明重復實驗 |
使用了不同批次的試劑 | 確保試劑來自同一試劑盒 | ||
板條受潮嚴重 | 板條要封好，干燥劑失效要及時更換 | ||
2 |
低 吸 光 度
OD 值
| 試劑過期，或者不同的批次混用 | 查證過期試劑和批次 |
洗液配制錯誤、洗滌浸泡時間過長 | 按照說明書要求洗滌，并正確配制洗液 | ||
孵育時間過短 | 按照說明書要求，嚴格計算好時間 | ||
試劑污染 | 確保吸取不同液體更換新的槍頭和盛放器皿 | ||
試劑溫度過低 | 根據試劑體積大小回溫時間相應延長，確保試劑*回溫 | ||
使用錯誤波長讀數，或者酶 標儀失靈 | 確保450nm波長讀數，檢查酶標儀是否故障 | ||
試劑盒處于的條件 | 使用完畢的部分請立即放回冰箱，勿置于過熱環境時間太長 | ||
3 | 過高的 背景值或吸光度（OD值） | 使用了質量差的水配制試劑 | 使用雙蒸水或去離子水配制試劑 |
洗滌不當或者洗板機洗板效果不好 | 增加1-2次洗滌，每孔至少加入250μL洗液 | ||
酶標儀失靈，如OD值讀數很高而顏色很淺 | 使用校正微孔板檢查酶標儀，檢查光源 | ||
實驗室溫度過高，反應時間過長 | 測定操作溫度是否合適，時間是否計算正確 | ||
試劑混淆，被污染或者配制不當 | 確保使用正確的試劑，準確配制，避免污染 | ||
4
| 板 內 差異性 大 | 加入標準品和樣品等的時間不* | 使用多道槍加樣，同種試劑加樣途中不能中斷 |
多道槍使用不當 | 校準多道槍，檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量* | ||
洗滌系統出現故障 | 檢查洗滌系統，保持良好運行 | ||
5 | 板 間 差 異 性 大
| 板與板之間孵育時間相差太大 | 獨立計時，確保*的孵育時間 |
板與板之間不*的洗滌過程 | 確保相同的洗滌次數，保證洗滌系統正常運作 | ||
使用移液槍不當 | 檢查移液槍，確保吸取相同液量 | ||
試劑和樣品處于不同溫度 | 確保盒內試劑和樣品液等充分回溫，如果試劑體積較大則需要回溫較長時間。不能用溫水浴回溫樣品 | ||
不同批次的試劑混用，或試劑盒過期 | 試劑不要混用，通常0標準品的OD值小于0.5顯示試劑質量下降 | ||
6 | 一個或多個標準品數據點超出曲線范圍 | 標準品添加順序混亂，或者放置于錯誤位置 | 按照說明要求重復實驗，保證標準品添加正確。 |
標準品被污染或與其他標準品混淆 | 改用新的標準品，按照由低濃度到高濃度的順序添加標準品 | ||
洗滌不*或者洗滌系統失靈 | 遵循一如既往的洗滌方式，檢查洗滌系統 | ||
加入標準品和試劑的時間不* | 由低到高濃度依次添加標準品，使用多道槍移液 | ||
多道槍使用不當 | 校準多道槍，檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量* |
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